GB 4789.40-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》詳細規(guī)定了食品中克羅諾桿菌屬（原稱阪崎腸桿菌）的檢驗方法，以下是對該標準檢測的詳細解讀：

一、適用范圍

該標準適用于嬰幼兒配方食品、乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌屬的檢驗?？肆_諾桿菌屬是一種重要的食源性條件致病菌，尤其對新生兒、早產兒及免疫力低下嬰兒構成嚴重威脅，可導致嬰兒罹患壞死性小腸結腸炎、菌血癥和腦膜炎等嚴重疾病。

二、檢驗原理

克羅諾桿菌屬的檢驗原理主要基于其在特定培養(yǎng)基上的生長、形態(tài)和生理生化特征。首先，使用無選擇性的緩沖蛋白胨水（BPW）進行前增菌，使受損的目標菌細胞恢復到正常而穩(wěn)定的生理狀態(tài)并進行一定程度的增殖。然后，轉接到選擇性較強的改良月桂基鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（mLST-Vm）中，利用該菌耐高滲透壓、44℃可生長的特性，在萬古霉素的作用下，抑制革蘭氏陽性菌和大部分的其他腸桿菌科細菌，使目標菌得以持續(xù)增殖。之后，用阪崎腸桿菌顯色平板進行選擇性分離，以得到肉眼可見的疑似菌落。Zui后，對疑似菌落利用生化反應（如氧化酶、發(fā)酵等）進行鑒定，判定是否檢出克羅諾桿菌屬。

三、檢驗程序

1. 樣品采集與處理：確保所取樣本具有代表性，并且在運輸和儲存過程中避免污染或變質。對于不同類型的食品，可能需要采取不同的前處理方式以利于后續(xù)實驗操作。

2. 前增菌：稱取一定量（如100g或100mL）的檢樣，置于滅菌錐形瓶中，加入預熱至44℃的BPW，用手緩緩搖動至檢樣充分溶解后，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h±2h。

3. 選擇性增菌：輕輕搖動混勻培養(yǎng)過的前增菌液，移取1mL轉入10mLmLST-Vm肉湯中，置于44℃±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h。

4. 分離培養(yǎng)：使用10μL接種環(huán)各取1環(huán)增菌培養(yǎng)物，分別劃線接種于2個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板上，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h（或按培養(yǎng)基要求條件培養(yǎng)）。挑取至少5個可疑菌落（不足5個時挑取全部可疑菌落），分別劃線接種于TSA平板上，置于25℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±4h。

5. 生化鑒定：自TSA平板上直接挑取黃色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊的可疑菌落，進行生化鑒定。建議直接選擇商品化的生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

6. 結果報告：綜合菌落形態(tài)和生化特征，報告每100g（或100mL）樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。

四、質量控制

1. 實驗過程中：每次實驗都要做空白對照。若空白對照平板上出現(xiàn)可疑菌落，應廢棄本次實驗結果，并對稀釋液、吸管、平皿、培養(yǎng)基、實驗環(huán)境等進行污染來源分析。

2. 環(huán)境污染控制：在每次檢驗過程中，于檢驗工作臺上打開兩塊阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進行培養(yǎng)，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

3. 培養(yǎng)基驗證：培養(yǎng)基須符合相關標準要求，并對每批次的培養(yǎng)基劃線接種標準菌株，以觀察菌落的生長特征是否正常。

五、技術升級與標準更新

GB 4789.40-2016標準已被GB 4789.40-2024標準替代，新標準在以下方面進行了優(yōu)化和補充：

1. 標準名稱：刪除了“阪崎腸桿菌”，修改為“食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌檢驗”。

2. 適用范圍：增加了嬰幼兒輔助食品。

3. 鑒定方法：增加了PCR鑒定方法作為選做內容，以提高檢測效率和準確性。

4. 生化鑒定項目：刪除了挑取黃色菌落和生化鑒定中的產黃色素和苦杏仁苷項目，因為部分克羅諾桿菌不產黃色素，且苦杏仁苷生化反應在不同品牌商業(yè)化生化管中的結果不一致。

5. 培養(yǎng)條件：修改了預熱、選擇性增菌溫度以及TSA平板的培養(yǎng)溫度和時間，以提高檢出率并縮短檢驗周期。

6. 培養(yǎng)基制備：修改了培養(yǎng)基和試劑的pH調節(jié)方法，以及氨基酸培養(yǎng)基的制備方法。