實驗原理
pTYNE載體在EGFP編碼框上游有2個錯碼的ATG起始密碼子，由于不能有效地啟動EGFP表達，pTYNE轉染細胞僅能發(fā)出很微弱的熒光。我們根據(jù)pTYNE載體的序列設計了pCas9/gRNA1對照陽性質粒pCas9-P，該質粒上的gRNA與pTYNE上EGFP編碼區(qū)上游結合。pCas9-P表達的Cas9蛋白和gRNA組合現(xiàn)對pTYNE載體切割，經(jīng)細胞修復后，突變的pTYNE將表達出讀碼框正確的EGFP蛋白，發(fā)出明亮的綠色熒光。
pCas9/gRNA1陽性對照載體（pCas9-P）靶序列：CTTCGAATTCTGCAGTCGA。該靶點位于pTYNEEGFP基因上游。
pCas9/gRNA1陰性對照載體（pCas9-N）靶序列：ATCGACTAGCCACTCAGAC。該序列為隨機序列。
pCas9-P靶點在pTYNE載體上的位置:
Cas9切割原理:
實驗內(nèi)容
1、實驗材料
pTYNE質粒（驗證載體，無內(nèi)毒素試劑盒制備；貨號：CR1011）
pCas9 –N質粒（pCas9/gRNA1陰性對照，貨號：CR1002，無內(nèi)毒素試劑盒制備）
pCas9 –P質粒（pCas9/gRNA1陽性對照，貨號：CR1002，無內(nèi)毒素試劑盒制備）
Polyfect-V轉染試劑（貨號：P2010-1）
293T細胞系
2、實驗步驟
1)轉染前24小時將293T鋪到24孔板中。同時準備2個孔。
2) 按照下列體系制備2個質粒稀釋液
組A | 組B |
pTYNE 0.4ug | pTYNE 0.4ug |
pCas9 –N 0.4ug | pCas9 –P 0.4ug |
DMEM培養(yǎng)基X ul | DMEM培養(yǎng)基 X ul |
總體積50ul | 總體積50ul |
3) 準備轉染試劑稀釋液：
Polyfect-V轉染試劑 3.2ul
DMEM培養(yǎng)基 96.8ul
4)將質粒稀釋液和轉染試劑稀釋液分別混勻。取50ul轉染試劑稀釋液分別加入兩組質粒稀釋液中，充分混勻，室溫孵育15min。
5) 將轉染液加入293T細胞。
6) 48小時后檢測EGFP熒光表達。
實驗結果
更新時間
- 統(tǒng)一社會信用代碼
- 110106012838889
- 成立日期
- 2010年05月10日
- 法定代表人
- 桂有靜
- 注冊資本
- 10 萬元 人民幣
主營產(chǎn)品
穩(wěn)轉細胞株構建，慢病毒包裝服務，microRNA服務，基因敲除服務
經(jīng)營范圍
生物、計算機的技術開發(fā)、技術服務、技術轉讓；軟件開發(fā)；經(jīng)濟信息咨詢（不含中介服務）；銷售生物試劑（不含危險化學品、不含藥品）、儀器儀表、塑料制品。
公司簡介
北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司致力于細胞基因編輯服務，我們提供細胞基因過表達服務；細胞rnai基因敲減服務以及talen基因敲除細胞系構建服務，并提供配套基因合成、rna干擾、talen基因敲除、慢病毒、腺病毒和腺相關病毒相關產(chǎn)品和服務。其中慢病毒、rna干擾和穩(wěn)定細胞株篩選已經(jīng)形成一套成熟的體系。公司的成員均為碩士和博士，有著多年專業(yè)分子生物學技術實踐經(jīng)驗，已經(jīng)成功為中科院、北京大學等知名研究院所和多家制藥企業(yè)提供技術服務。...
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