使用Cas9kit配套篩選載體對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行篩選-_歐美熟婦videosgratis
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實(shí)驗(yàn)原理
pEGFP/puro為提高基因敲除實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性細(xì)胞檢出率設(shè)計(jì)的載體，表達(dá)EGFP熒光蛋白和puromycin抗性基因。使用時(shí)pEGFP/puro與pCas9/gRNA1載體或者pCas9/gRNA3載體共轉(zhuǎn)染，用熒光標(biāo)簽或者嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行初步篩選，可以顯著提高基因敲除成功細(xì)胞的陽(yáng)性率，減少后續(xù)細(xì)胞克隆檢測(cè)數(shù)量。這個(gè)步驟對(duì)于轉(zhuǎn)染效率較低的細(xì)胞尤其有效。
簡(jiǎn)要步驟
設(shè)計(jì)靶點(diǎn)→構(gòu)建pCas9/gRNA1載體→與pEGFP/puro共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞→嘌呤霉素篩選2-3天→陽(yáng)性細(xì)胞克隆擴(kuò)增→檢測(cè)基因敲除效果
靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和基因敲除載體構(gòu)建
方法請(qǐng)參考pCas9/gRNA1載體說(shuō)明書(shū)或者Cas9試劑盒說(shuō)明書(shū)。
實(shí)驗(yàn)步驟
1)轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將293T鋪到6孔板中。
2) 按照下列體系制備質(zhì)粒稀釋液
pCas9/gRNA1 0.8ug |
pEGFP/puro0.08ug |
DMEM培養(yǎng)基X ul |
總體積50ul |
3)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑稀釋液：
Polyfect-V轉(zhuǎn)染試劑 1.6ul
DMEM培養(yǎng)基 48.4ul
4)將質(zhì)粒稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液分別混勻。取50ul轉(zhuǎn)染試劑稀釋液分別加入兩組質(zhì)粒稀釋液中，充分混勻，室溫孵育15min。
5) 將轉(zhuǎn)染液加入293T細(xì)胞。
6) 24小時(shí)后加入puromycin至合適濃度。
7）篩選3天后消化細(xì)胞，用有限稀釋法將細(xì)胞接種到96孔板，標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞的孔，做單克隆細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)不加puromycin。
8）約7-10天，細(xì)胞形成克隆。消化細(xì)胞，將部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，部分細(xì)胞提取基因組DNA檢測(cè)基因敲除結(jié)果。
用到的產(chǎn)品：
pTYNE載體 貨號(hào)：CR1011
pCas9/gRNA1載體 貨號(hào)：CR1001
基因敲除 , 慢病毒載體 , 構(gòu)建pCas9/gRNA1載體
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建，慢病毒包裝服務(wù)，microRNA服務(wù)，基因敲除服務(wù)
生物、計(jì)算機(jī)的技術(shù)開(kāi)發(fā)、技術(shù)服務(wù)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓；軟件開(kāi)發(fā)；經(jīng)濟(jì)信息咨詢（不含中介服務(wù)）；銷售生物試劑（不含危險(xiǎn)化學(xué)品、不含藥品）、儀器儀表、塑料制品。
北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司致力于細(xì)胞基因編輯服務(wù)，我們提供細(xì)胞基因過(guò)表達(dá)服務(wù)；細(xì)胞rnai基因敲減服務(wù)以及talen基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)，并提供配套基因合成、rna干擾、talen基因敲除、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒相關(guān)產(chǎn)品和服務(wù)。其中慢病毒、rna干擾和穩(wěn)定細(xì)胞株篩選已經(jīng)形成一套成熟的體系。公司的成員均為碩士和博士，有著多年專業(yè)分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)成功為中科院、北京大學(xué)等知名研究院所和多家制藥企業(yè)提供技術(shù)服務(wù)。...