pCas9 gRNA3基因敲除載體對(duì)照實(shí)驗(yàn)-國(guó)產(chǎn)片婬亂一級(jí)吃奶毛片視頻,最近亞洲中文字幕_不要太漲了好深撞開メイリン モデルコレクション メ
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實(shí)驗(yàn)原理
pTYNE載體在EGFP編碼框上游有2個(gè)錯(cuò)碼的ATG起始密碼子，由于不能有效地啟動(dòng)EGFP表達(dá)，pTYNE轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅能發(fā)出很微弱的熒光。
pCas9/gRNA3載體需要成對(duì)發(fā)揮作用。我們根據(jù)pTYNE載體設(shè)計(jì)構(gòu)建了pCas9/gRNA3陽(yáng)性對(duì)照載體pCAS9-Pf、pCas9-Pr。由于Cas9Nicknase對(duì)一個(gè)靶點(diǎn)切割后形成的DNA單鏈斷裂會(huì)被修復(fù)，幾乎不會(huì)引起DNA序列改變。我們用pCAS9-Pf與pTYNE共轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照組，pCAS9-Pf、pCas9-Pr與pTYNE三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染作為陽(yáng)性對(duì)照組。pCAS9-Pf、pCas9-Pr共同切割pTYNE載體，使pTYNE載體DNA雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞修復(fù)后，突變的pTYNE將表達(dá)出讀碼框正確的EGFP蛋白，發(fā)出明亮的綠色熒光。
pCas9/gRNA3陽(yáng)性對(duì)照載體（pCas9-Pf）靶序列：CGAAGCTTGAGCTCGAGCCA。
pCas9/gRNA3陽(yáng)性對(duì)照載體（pCas9-Pr）靶序列：TACCGCGGGCCCGGGATCCT。
Pf、Pr靶點(diǎn)在pTYNE載體上的位置:
Cas9Nicknase切割原理:
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、實(shí)驗(yàn)材料
pTYNE質(zhì)粒（驗(yàn)證載體，無(wú)內(nèi)毒素試劑盒制備；貨號(hào)：CR1011）
pCas9-Pf質(zhì)粒（pCas9/gRNA3陽(yáng)性對(duì)照，貨號(hào)：CR1012，無(wú)內(nèi)毒素試劑盒制備）
pCas9-Pr質(zhì)粒（pCas9/gRNA3陽(yáng)性對(duì)照，貨號(hào)：CR1012，無(wú)內(nèi)毒素試劑盒制備）
Polyfect-V轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)：P2010-1）
293T細(xì)胞系
2、實(shí)驗(yàn)步驟
1)轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將293T鋪到24孔板中。同時(shí)準(zhǔn)備2個(gè)孔。
2) 按照下列體系制備2個(gè)質(zhì)粒稀釋液
組A | 組B |
pTYNE 0.4ug | pTYNE 0.4ug |
pCas9-Pf 0.4ug | pCas9-Pf 0.2ug |
| - | pCas9-Pr0.2ug |
DMEM培養(yǎng)基X ul | DMEM培養(yǎng)基 X ul |
總體積50ul | 總體積50ul |
3) 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑稀釋液：
Polyfect-V轉(zhuǎn)染試劑 3.2ul
DMEM培養(yǎng)基 96.8ul
4)將質(zhì)粒稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液分別混勻。取50ul轉(zhuǎn)染試劑稀釋液分別加入兩組質(zhì)粒稀釋液中，充分混勻，室溫孵育15min。
5) 將轉(zhuǎn)染液加入293T細(xì)胞。
6) 48小時(shí)后檢測(cè)EGFP熒光表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
慢病毒載體 , 基因敲除 , 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 , 載體構(gòu)建 , pTYNE載體
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建，慢病毒包裝服務(wù)，microRNA服務(wù)，基因敲除服務(wù)
生物、計(jì)算機(jī)的技術(shù)開發(fā)、技術(shù)服務(wù)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓；軟件開發(fā)；經(jīng)濟(jì)信息咨詢（不含中介服務(wù)）；銷售生物試劑（不含危險(xiǎn)化學(xué)品、不含藥品）、儀器儀表、塑料制品。
北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司致力于細(xì)胞基因編輯服務(wù)，我們提供細(xì)胞基因過(guò)表達(dá)服務(wù)；細(xì)胞rnai基因敲減服務(wù)以及talen基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)，并提供配套基因合成、rna干擾、talen基因敲除、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒相關(guān)產(chǎn)品和服務(wù)。其中慢病毒、rna干擾和穩(wěn)定細(xì)胞株篩選已經(jīng)形成一套成熟的體系。公司的成員均為碩士和博士，有著多年專業(yè)分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)成功為中科院、北京大學(xué)等知名研究院所和多家制藥企業(yè)提供技術(shù)服務(wù)。...