試劑制備

1X Assay/LysisBuffer：實驗前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mMPMSF， 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細胞

1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制l劑進行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用27?的注射l器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，G蛋白活性檢測試劑盒，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g， 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克l隆抗l體能夠特異性的識別Cdc42-GTP結(jié)合蛋白，而不識別Cdc42-GDP結(jié)合蛋白，進而簡單并且快速的進行Cdc42的活性檢測。同時試劑盒中的Cdc42-GTP單克l隆抗l體也可以進行免l疫組化實驗中細胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進行20次檢測。

小G蛋白是從屬于細胞調(diào)節(jié)因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族，它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種，Cdc42參與生理活動過程中其分子結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)出2種相互轉(zhuǎn)換的形式：與GTP結(jié)合的激l活狀態(tài)和與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)。

目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學功能，進而間接的進行Cdc42活性l功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結(jié)合蛋白與p21結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導致這種檢測方法的重復性較差。

G蛋白活性檢測試劑盒-武漢紐斯特生物技術(shù)(圖)由武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司提供。武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司是從事“G蛋白活性,cAMP和cGMPELISA試劑盒,蛋白點突變”的企業(yè)，公司秉承“誠信經(jīng)營，用心服務”的理念，為您提供更好的產(chǎn)品和服務。歡迎來電咨詢！聯(lián)系人：黃經(jīng)理。