電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到PVDF或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應(yīng)和檢測(cè)（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3.孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時(shí)，或者4°C條件下過(guò)夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5.孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如ECL顯色法。

電泳和轉(zhuǎn)移

1向聚丙l烯酰胺凝膠（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建議包括預(yù)染色MW標(biāo)準(zhǔn)（作為成功轉(zhuǎn)入的指標(biāo)步驟3）。

2按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行SDS-PAGE。

3按照制造商的說(shuō)明，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或硝化纖維膜上說(shuō)明。

免l疫印跡檢測(cè)（所有步驟均在室溫下攪拌）

1在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入甲l醇中15次

然后在室溫下干燥5分鐘。

如果使用硝基纖維素，則應(yīng)跳過(guò)此步驟。

2室溫下用5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封閉1小時(shí)

不斷地?cái)噭?dòng)。

用抗Arl1單克l隆抗l體孵育，新鮮稀釋1:50~1000

（取決于樣品中Arl1蛋白質(zhì)的含量）5%脫脂奶粉或3%

BSA/TBST，室溫下持續(xù)攪拌1-2小時(shí)或4o

過(guò)夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

4用二級(jí)抗l體（例如山羊抗鼠IgG，HRP結(jié)合物）培養(yǎng)膜，

在室溫下，在5%脫脂奶粉或3%BSA/TBST中新鮮稀釋1:1000，1小時(shí)

不斷地?cái)噭?dòng)。

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

6使用您選擇的檢測(cè)方法，如ECL。

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)NewEastBio在中國(guó)的子公司。美國(guó)NewEastBio專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等。

懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后通過(guò)離心沉淀細(xì)胞。

3.吸出培養(yǎng)基，IP-WB活性檢測(cè)試劑盒，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通過(guò)重復(fù)移液裂解細(xì)胞。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果這

   發(fā)生時(shí)，裂解液可通過(guò)27?號(hào)注射l器針頭3-4次以剪切

   基因組DNA。

8.通過(guò)離心10分鐘（在4°C下為12，000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-

   70°C以備將來(lái)使用。

陽(yáng)性和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

    注意：體內(nèi)刺激細(xì)胞會(huì)激l活大約10％的可用Rab35，而

    體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活近90％的Rab35。

1.將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Rab35蛋白）。

2.向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM終濃度）。

3.將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4.在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5.在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6.通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。

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