體外細(xì)胞毒性試驗測試常用方法有哪些？ MTT法：
1、將配制好的1×105/mL細(xì)胞懸液接種于96孔板，設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組，每組各設(shè)至少6孔，每孔接種100uL細(xì)胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱（含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳?xì)怏w）37℃培養(yǎng)24h。
2、培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液，空白對照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對照組加入陰性對照品浸提液，陽性對照組加入陽性對照溶液或陽性對照品浸提液，供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液（75%、50%、25%），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。
3、更換培養(yǎng)液24h后，置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入50uL質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄去孔內(nèi)液體，加入100uL異丙醇，置振蕩器上振蕩，在酶標(biāo)儀570nm和650nm波長下測定吸光度，計算相對增殖率（RGR）。
直接接觸法：
1、 將已培養(yǎng) 48h～72h 生長旺盛的細(xì)胞用消化液消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù)，將細(xì)胞懸液配制成密度1.0×105/mL，接種于直徑 35mm 培養(yǎng)皿，每皿 2mL，共 9 皿。置 CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）培養(yǎng)至近匯合單層細(xì)胞形成。
2、 棄去原培養(yǎng)液。加入 2mL 新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中央部位的細(xì)胞層上輕輕放置一片供試樣品，共 3 皿。同法操作陰性對照、陽性對照各 3 皿。置 CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）繼續(xù)培養(yǎng) 24h。
3、 培養(yǎng)結(jié)束后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和膜完整性等方面的變化，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷試驗樣品分級，分級大于 2級時被認(rèn)為有細(xì)胞毒性作用。
瓊脂擴(kuò)散法：
1、將已培養(yǎng)48h～72h生長旺盛的細(xì)胞用消化液消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù)，將細(xì)胞懸液配制成密度1.0×105/mL，接種于直徑35mm培養(yǎng)皿，每皿2mL，共9皿。置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）培養(yǎng)至近匯合單層細(xì)胞形成。
2、棄去器皿中的培養(yǎng)基，將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養(yǎng)基混合,使瓊脂*終質(zhì)量濃度為0.5%～2%,并吸取適宜體積加入至每只培養(yǎng)皿內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)只能使用適合于哺乳動物細(xì)胞生長的瓊脂。這種瓊脂/培養(yǎng)基的混合物宜為液態(tài),并且溫度適合于哺乳動物細(xì)胞。加入2mL中性紅液并在CO2培養(yǎng)箱孵育30min，孵育后丟棄多余的中性紅液，將試驗樣品的平行試樣小心地放在每只培養(yǎng)皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細(xì)胞層表面約十分之一，共3皿。同法操作陰性對照、陽性對照各3皿。置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃，＞90%濕度）繼續(xù)培養(yǎng)24h。
3、培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)皿上的試樣小心地從固化瓊脂層取下，于顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和膜完整性等方面的變化，根據(jù)表1判斷試驗樣品分級，分級大于2級時被認(rèn)為有細(xì)胞毒性作用。