GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》中14.6部分詳細(xì)規(guī)定了小鼠睪丸精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的方法與要求，該試驗(yàn)旨在評(píng)估農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的遺傳毒性，通過(guò)檢測(cè)受試物引起小鼠睪丸精母細(xì)胞染色體畸變的效應(yīng)，預(yù)測(cè)其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。

一、試驗(yàn)原理

雄性生殖細(xì)胞從精原細(xì)胞發(fā)育成成熟精子需要經(jīng)過(guò)多個(gè)發(fā)育階段，不同發(fā)育階段的雄性生殖細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同。初級(jí)精母細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘變比較敏感，在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中，DNA合成是在初級(jí)精母細(xì)胞細(xì)線期以前的各階段細(xì)胞中進(jìn)行，以后發(fā)育的細(xì)胞不再進(jìn)行DNA合成。因此，受試物需在前細(xì)線期給予，于小鼠第一次接觸受試物后的第12~14天采樣制片，可以觀察到前細(xì)線期接觸引起的精母細(xì)胞染色體畸變效應(yīng)。

二、試驗(yàn)動(dòng)物與分組

動(dòng)物選擇：選用6~8周齡健康雄性小鼠，每組應(yīng)保證至少有5只存活小鼠。

分組設(shè)計(jì)：

陰性對(duì)照組：使用等體積的溶劑。

陽(yáng)性對(duì)照組：使用已知具有誘變作用的物質(zhì)，如絲裂霉素C（1.5~2mg/kg，腹腔注射一次）或環(huán)磷酰胺（40mg/kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)5天）。

受試物組：設(shè)3個(gè)劑量組，根據(jù)急性LD50，選用可使動(dòng)物出現(xiàn)輕中毒癥狀、體重略有下降、不引起動(dòng)物死亡的劑量為高劑量，按2~3倍組間間距設(shè)中、低劑量組。

三、試驗(yàn)方法

受試物接觸方法：受試物接觸途徑應(yīng)與實(shí)際接觸途徑一致或接近，可采取一次接觸或每天1次、連續(xù)5天的方法。

取樣時(shí)間：各組均于第一次接觸受試物后第12~14天將動(dòng)物處死制片。

制片步驟：

動(dòng)物處死前處理：處死前6小時(shí)腹腔注射秋水仙素（4mg/kg，0.04%秋水仙素按0.1ml/10g體重給予）。

睪丸取出與處理：以頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)睪丸，去凈周圍組織和脂肪，用低滲液洗去毛和血污后，放入盛有適量低滲液的小平皿中。

低滲處理：用眼科鑷撕開(kāi)睪丸被膜，輕輕分離曲精管，加低滲液至8~10ml，室溫下低滲20~40分鐘（低滲時(shí)間視室溫條件而定）。

固定處理：仔細(xì)吸盡低滲液，加固定液10ml，固定20分鐘。必要時(shí)可存放在冰箱中過(guò)夜，但軟化前應(yīng)將固定液吸掉，再加入新鮮配制的固定液，固定10分鐘。

軟化與離心：吸盡固定液，加60%冰醋酸1~2ml，待大部分曲細(xì)精管軟化后立即加入倍量的固定液，用吸管打勻，移入離心管，以1000r/min離心10分鐘。

制片：棄去大部分上清液，留下約0.5~1.0ml，充分打勻制成細(xì)胞混懸液。將細(xì)胞混懸液均勻地滴于冰水玻片上，每個(gè)樣本制片2~3張。

染色與觀察：用1:10Giemsa染液（pH6.8）染色20~40分鐘，立即用蒸餾水或pH6.8的磷酸緩沖液沖洗，晾干后放入片盒中保存。

四、觀察指標(biāo)與結(jié)果判定

觀察指標(biāo)：主要觀察染色體畸變類型，包括裂隙、斷片、微小體、相互易位、X-Y和常染色體的單價(jià)體等。

結(jié)果判定：

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)每個(gè)動(dòng)物記錄含染色體結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞數(shù)和每個(gè)細(xì)胞的染色體畸變數(shù)，按二項(xiàng)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

陽(yáng)性結(jié)果判定：劑量組染色體畸變率與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.05），且有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，符合以上條件即可判定為染色體畸變陽(yáng)性。染色體裂隙應(yīng)分別記錄和報(bào)告，一般不計(jì)入畸變率。

五、質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)

質(zhì)量控制要點(diǎn)：

受試物配制：應(yīng)新鮮配制，固體受試物需溶解或懸浮于適當(dāng)溶劑。

秋水仙素使用：宜當(dāng)天新鮮配制，確保中期阻斷效果。

固定液配制：需新鮮配制，甲醇與冰乙酸比例為3:1。

低滲時(shí)間控制：精原細(xì)胞10分鐘，精母細(xì)胞20分鐘。

滴片操作：滴片時(shí)玻片需預(yù)冷，確保染色體分散良好。

染色時(shí)間調(diào)整：根據(jù)室溫調(diào)整染色時(shí)間，通常20分鐘左右。

鏡檢選擇：選擇背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相進(jìn)行觀察。

注意事項(xiàng)：

動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：應(yīng)符合GB 14925有關(guān)規(guī)定。

受試物給予量：一次給予的Zui大容量不應(yīng)超過(guò)0.2ml/10g體重，如劑量較大，可在一天內(nèi)分兩次給予。

陰性對(duì)照組處理：除不使用受試物外，其他處理與受試物組一致。

陽(yáng)性對(duì)照組預(yù)期：應(yīng)預(yù)期在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞觀察到高于背景的染色體畸變?cè)黾印?/p>