固氮酶是一種能夠?qū)⒌肿舆€原成氨的酶。固氮酶是由兩種蛋白質(zhì)組成的：一種含有鐵，叫做鐵蛋白，另一種含鐵和鉬mo3+，稱為鉬鐵蛋白。鉬鐵蛋白中含有7個鐵，9個硫，1個鉬，1個中心碳。

固氮酶結(jié)構(gòu)

1、Fe蛋白

Fe蛋白由nifH基因編碼。對多種生物固氮酶鐵蛋白的一級結(jié)構(gòu)的測定結(jié)果表明，F(xiàn)e蛋白都不含色氨酸，酸性氨基酸的含量均高于堿性氨基酸，各屬種間的同源性為45%～90%，說明鐵蛋白的基本結(jié)構(gòu)較為保守。

Fe蛋白是兩個相同的亞基組成的γ2型二聚體。二聚體的分子量約為59～73kD(因菌種不同而差異)，每個亞基的分子量約30kD。兩個亞基通過一個[4Fe-4S]金屬簇橋連，每個亞基的核心是一個由8個β折疊片形成的平面，側(cè)面與9條α螺旋相連。在二聚體兩個亞基的界面之間還存在大量的氫鍵和靜電作用。這些作用力很強(qiáng)，即使[4Fe-4S]簇被抽提，鐵蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)仍能保持。

2、MoFe蛋白

Kennedy等人通過SDS-PAGE法，發(fā)現(xiàn)鉬鐵蛋白含有兩種亞基，已經(jīng)確定其為異四聚體(α2β2)，分子量約220k～240kD之間(因不同來源而異)。α亞基分子量為55kD，由nifD基因編碼，大小約為500個氨基酸，氨基酸序列的同源性在47%～66%，具有相當(dāng)高的保守性。

在已知的α亞基氨基酸序列中，有5個Cys殘基(Cys62、Cys88、Cys154、Cys183、Cys275)是絕對保守的，可能和鉬鐵蛋白中金屬原子簇的生物合成有關(guān)。nifK基因編碼的β亞基分子量為60kD，氨基酸序列與α亞基比較相似。α亞基和β亞基之間存在廣泛的相互作用，它們構(gòu)成一個近似軸對稱的αβ，兩個αβ二聚體以近似軸對稱的方式交聯(lián)起來，形成了α2β2四聚體。

防氧保護(hù)機(jī)制

固氮菌在進(jìn)化過程中，發(fā)展出多種機(jī)制來解決既需氧又防止氧對固氮酶的操作損傷的矛盾。

1、固氮菌以較強(qiáng)的呼吸作用迅速地將周圍互不干涉中的氧消耗掉，使細(xì)胞周圍處于低氧狀態(tài)，保護(hù)固氮酶不受損傷。

2、在根瘤菌中，以豆血紅蛋白與氧氣結(jié)合的方式使豆血紅蛋白周圍的氧氣維持在一個極低的水平。

3、有些固氮菌能形成一個阻止氧氣通過的粘液層。

活性檢測——乙炔還原法

1、取盆栽土樣 1- 5 g 于 100 mL 血清瓶中，加入 0. 1mol/L 葡萄糖液 2 mL，塞上異丁基膠塞搖勻，加鋁蓋密封。用注射器從瓶中抽出 5 mL 空氣再注入等體積乙炔氣體，密封針眼，28℃培養(yǎng) 2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取 500 μL 氣樣在氣相色譜儀上測定乙烯峰值。

2、取0.1g-0.5g菌或0.5-1ml菌液 5于 100 mL血清瓶中，加入 0. 1 mol/L 葡萄糖液 2 mL，塞上異丁基膠塞搖勻，加鋁蓋密封。用注射器從瓶中抽出 5 mL空氣再注入等體積乙炔氣體，密封針眼，28 ℃培養(yǎng) 2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取 500 μL 氣樣在氣相色譜儀上測定乙烯峰值。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

1、DB23/T 3169-2022大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤能力與固氮效果評價技術(shù)規(guī)程

2、NY 411-2000 固氮菌肥料

3、TCVN生物固氮肥

4、T/DGAS 004-2018 玉米固氮菌肥料

5、DB65/T 3323-2011 陸生固氮藍(lán)藻固沙技術(shù)規(guī)程